好嗨喲~單細胞測序技術原理及應用的視頻課來了~

GCBI知識庫2019-01-14 18:01:18

看了就要關注我,喵嗚~


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年底總是最忙的時候,公司裡的小夥伴都是“一心想搶火車票,奈何工作沒做完!”


經過幾周的籌備,第一個單細胞測序視頻終於出來啦!(終於可以去搶火車票了~噓)


由於之前寫過太多單細胞相關內容,所以本節課只向大家簡短地介紹10x Genomincs單細胞測序技術的技術原理及應用。


接下來,我們跟著孔培濤老師一起走進單細胞測序的世界!



“單細胞測序全搞定”-1


10XGenomics 

單細胞轉錄組測序原理及應用



01

10x Genomincs的原理



  1. 含有 Barcode  信息的 Gel beads 在微流體“雙十字”交叉系統的第一個進樣口與樣品和酶的混合物混合;在微流體“雙十字”交叉系統的第二個進樣口與油表面活性劑結合形成GEMs;


  2. Gel beads 溶解釋放 Barcode 序列,開始對細胞進行標記;


  3. 以GEMs(含有Barcode的Gel beads和細胞、反應試劑的混合物)構建標準測序文庫。


02

單細胞轉錄組測序文庫構建原理



03

單細胞轉錄組測序的應用


傳統的Bulk 測序手段針對細胞集合進行測序,通常會錯失很多重要信息。主要是因為細胞集合研究反映的是這一細胞集合的平均水平,而單個細胞間表達的信息往往千差萬別。


因此,相對於Bulk RNA-seq,單細胞轉錄組測序的應用核心是:劃分細胞群體以及檢測細胞群體間的差異表達基因。


04

應用實例簡介


Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq(Tirosh et al., 2016, Science)


研究背景

為了探索黑色素瘤腫瘤的獨特基因型和表型狀態,研究者從19例患者中分離出4645個單細胞,應用單細胞轉錄組測序,對惡性、免疫、間質和內皮細胞進行定性分析。


研究過程


  • 單細胞轉錄組測序解析黑色素瘤

▲圖1 A. 實驗流程。B. 利用大規模CNVs區分惡性細胞和非惡性細胞。C和D.  單細胞表達譜區分惡性和非惡性細胞類型。



  • 單細胞轉錄組測序在惡性細胞中區分細胞週期和其他狀態

▲圖2 A. 惡性腫瘤細胞的細胞週期的評估。B和C.  IHC(免疫組化)和IF(免疫熒光)驗證了細胞頻率的一致性。D. 不同癌細胞的基因表達圖譜。



  • 單細胞轉錄組測序分析發現大量潛伏的耐藥黑色素亞群的異質性


▲圖3 A. 基於平均表達特徵將腫瘤分層。B. 揭示腫瘤內部異質性。C. 免疫熒光證實同一腫瘤內單個細胞之間的互斥性。D. 證實黑色素瘤的惡性細胞中同時存在高AXL和高MITF轉錄狀態。E. 評估AXL與RAF/MEK抑制抵抗之間的聯繫。



  • 大量黑色素瘤的去卷積分析揭示了細胞與細胞之間的相互作用

▲圖4 A.  黑色素瘤樣品的TCGA結果展示。B. 推測CAFs和T細胞之間的細胞間相互作用。C.  定量免疫揭示了樣本間的相關性。D. 驗證CAFs衍生的互補因子與T細胞浸潤之間的相關性。



  • T細胞衰竭標誌物的激活依賴和獨立變異。

▲圖5  A.  單個T細胞分層及其激活狀態示意圖。B. T細胞中細胞毒性、衰竭和原始細胞狀態標記物的平均表達水平圖。C. 免疫熒光實驗驗證共表達。D. 高細胞毒性T細胞衰竭狀態的激活獨立變異。 E-F. 高低衰竭細胞毒性CD8+ T細胞的相對錶達。G. 探討T細胞狀態與克隆擴增的關係。H. 驗證T細胞的擴張與衰竭有關。




上週的幸運兒~


上週四獲獎的幸運兒已經收到書啦~

恭喜~




下週課程預告


下週四晚八點,將由金特達基因-技術經理蒯文濤老師給大家詳細講解單細胞測序課題設計、應用實例。


歡迎關注,不見不散!


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